疫苗与中和抗体是抗击新冠病毒的两把利器，被人们寄予厚望，当前有大量的研究工作在这两个领域展开。不同类型的疫苗，其开发的技术路线大相径庭，本文将重点关注重组蛋白疫苗的开发路线。

在确认免疫原后，可以将其开发为重组蛋白疫苗，亦可以筛选中和抗体作为治疗手段。以下，我们将逐一介绍免疫原发现和改造、基于噬菌体展示技术和杂交瘤技术的抗体发现、以及重组蛋白/抗体生产用细胞株开发的工作流程。

一.免疫原发现和改造流程

不同疫苗开发平台（比如灭活病毒与 DNA 疫苗 ）之间的工作流程千变万化，各有各的优势。CEPI（ Coalition for Epidemic Preparedness Innovations ），以及许多的其他机构，在全球性流行病中推动了这些多样化的对策以增加对抗感染源的成功率。这里，我们重点介绍了利用重组蛋白作为免疫原开发疫苗的通用工作流程，其中提到的系统可以帮助您的研究工作。

1.筛选免疫原

采用噬菌体展示的方法筛选病毒抗原，作为潜在的疫苗候选物。

2.免疫原表征

免疫原性研究确认上述步骤发现的抗原是否会激发免疫反应。如果抗原激发免疫反应（ 常用 ELISA 检测 ），那么这个抗原就被认为免疫原而继续研究。更多的表征工作用于在后续的蛋白质改造工程中将目标属性引入免疫原。

3.蛋白质（免疫原）改造工程

免疫原的一些属性会导致注射入动物或人后出现不良反应。因此，需要使用一些基因编辑工具，如 CRISPR / Cas9 ，改造免疫原的 DNA 基因，从而消除这些属性。

4.细胞转染和克隆

待 DNA 序列优化后，需要放大免疫原的生产用于后续测试。在这个阶段，构建高表达、单克隆源性的细胞株非常关键。这个阶段涉及基因工程、转染以及单细胞克隆，尤其是采用哺乳动物细胞株作为宿主细胞。

5.筛选表达量和质量属性

在单细胞克隆后，监测细胞的生长并评估表达量。纯化并制备免疫原用于动物注射以激发免疫反应。待动物产生抗体后，通过病毒中和试验评估疫苗效力。

二.基于噬菌体展示技术的抗体发现流程

噬菌体展示是一种用于研究展示于噬菌体表面的蛋白与另一个分子如肽段、DNA 或者其他蛋白质相互作用的技术。噬菌体展示常用于发现抗原抗体之间的高亲和相互作用，这在发病机制研究、疫苗及其他治疗方法开发中发挥关键作用。

1.淘洗

淘洗是一个富集高亲和力噬菌体的重复过程。

2.克隆挑取

上一步筛选到的噬菌体被克隆随后被挑取以分离每个独特的结合蛋白。

3.抗原抗体相互作用

淘洗阶段，展示高亲和力蛋白的噬菌体从低亲和力噬菌体中被筛选出来。这个定性的筛选过程需要用更加定量的免疫分析验证以评估抗原抗体的相互作用，比如 ELISA、免疫荧光、HTRF，补体结合实验、凝集反应和/或沉淀反应。

4.功能筛选

通过抗原抗体相互作用的表征后，常使用基于细胞的实验对候选分子的功能活性做进一步筛选（ 如病毒中和实验或疫苗效力 ）。

三.基于杂交瘤技术的抗体发现流程

杂交瘤技术是将分泌抗体的 B 细胞与永生化的骨髓瘤细胞融合得到杂交细胞 ( 即杂交瘤细胞 ) 从而用于大量生产抗体的一种技术。因为 B 细胞分泌不同的抗体，因此需要对杂交瘤细胞做单细胞克隆从而得到一个大型的单克隆抗体文库，这常常被用于预防、诊断或治疗疾病。

1.融合

将表达特异抗体的 B 细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞的过程。

2.克隆筛选

发现特异性或高表达单抗的单克隆源性的杂交瘤细胞系。

3.细胞生长分析

利用无标记成像在一段时间内监测细胞增殖从而评估细胞生长。

4.特异性和交叉反应

分析抗体与目标抗原结合的能力。

5.结合亲和力和内化

结合亲和力表征生物分子 ( 如蛋白质或 DNA ) 与其配体或结合对象 ( 如药物或抑制剂 ) 互作结合的强度。内化是监测目标颗粒进入细胞的能力的过程。

四.稳定细胞株开发流程

细胞株开发是一个建立单克隆源性的细胞群体的过程，用于在一段时间内表达所需特征( 比如生产重组蛋白 ) 。当单个细胞增殖形成克隆后可对其性状开展评估。

1.稳转

细胞株开发流程的起点是将外源 DNA ( 编码目标重组蛋白 ) 导入宿主细胞，这个过程即为转染。转染后，细胞会在短暂的一段时间 ( 通常不超过一周 ) 内表达外源蛋白，最终完全停止表达。但是，其中的小部分细胞会维持长时间表达重组蛋白的能力，这是由于外源 DNA 整合至其基因组中。它们是稳转细胞，被挑选出来后进入下一步实验。

2.细胞池富集

编码感兴趣蛋白的外源 DNA 还包含筛选基因，可用于将稳转细胞从未转染细胞中筛选出来。比如将绿色荧光蛋白 （GFP)）加到外源 DNA 中，这样转染的细胞会呈现荧光，可以与未转染的细胞 ( 没有荧光 ) 区分开来。重组蛋白的表达水平与 GFP 信号强度之间存在强相关性，因此研究人员可以利用 GFP 信号强度发现并富集高表达的细胞。

3.单细胞分离

稳转的过程，不管是靶向的还是随机的，都会产生表达水平不同的异质细胞群。因此，必须分离和克隆单个细胞以保证细胞群体的基因一致性，从而显著降低表达的异质性。单细胞分离是一个从实体组织或细胞悬液中分离出单个活细胞用于后续分析的过程。

4.单克隆性验证和细胞生长分析

单细胞克隆是细胞株开发中非常关键的一步。确认在微孔中分离出单个细胞非常重要，且通常使用细胞成像仪记录。克隆阶段后对细胞继续监测分析其生长，从而确认其生长属性没有显著变化。这是一个追踪单个细胞生长变成克隆的过程。

5.表达量和关键质量属性筛选

检测细胞表达的重组蛋白或抗体的浓度及其他指标。

更多详情请关注Molecular Devices美谷分子仪器官网